Mathieu Morel Weizmann Forex

eterogeneità cellulare media insito compromesso sensitivityspecificity nel cancro targeting per circuiti sintetici Mathieu Morel a. b. c. 1. romana Shtrahman a. 1. Varda Rotter d. Lior Nissim e. 2. e Roy H. Bar-Ziv a. 2 Dipartimento di Materiali e Interfacce, Weizmann Institute of Science. Rehovot, Israele, 76100 b Ecole Normale Suprieure, Paris Sciences et Lettres (PSL) University Research, Universit Pierre et Marie Curie, CNRS. Dpartement de Chimie, UMR 8640 Pasteur, 75005 Parigi, Francia c Universit Pierre et Marie Curie di Parigi 06, cole Normale Suprieure, CNRS. UMR 8640 Pasteur, 75005 Parigi, Francia d Dipartimento di biologia cellulare molecolare, Weizmann Institute of Science. Rehovot, Israele, 76100 e Biologia Sintetica Center, Massachusetts Institute of Technology. Cambridge, MA 02139 A cura di Jos N. Onuchic, Rice University, Houston, TX, e approvato 3 Giugno 2016 (ricevuto per la revisione 16 marzo 2016) Significato L'anticipo recente l'uso di vettori virali per la consegna del gene, in combinazione con il progettazione di circuiti genici sintetici diagnosticare e cellule bersaglio, è fonte di opportunità per il trattamento efficace del cancro. Finora, circuiti genici sono stati considerati dispositivi logici grado di discriminare normale da cellule maligne come stati discreti, ignorando eterogeneità cellulare in marcatori espressione cancro. Abbiamo affrontato le limitazioni inerenti eterogeneità impone la precisione di targeting circuiti. Uso dei parametri molecolari per il controllo circuito di amplificazione guadagno e soglia, mostriamo un compromesso intrinseco emerge tra specificità e sensibilità. Alla luce di questo compromesso, l'ottimizzazione molecolare dei circuiti di targeting sarà un passo importante per l'attuazione efficace della terapia genica personalizzata. circuiti gene sintetico stanno emergendo come un mezzo versatile per indirizzare il cancro con una maggiore specificità per l'integrazione combinatoria di più marcatori di espressione. Tali circuiti devono essere sintonizzati per essere altamente sensibile a causa di fuga anche di poche cellule potrebbe essere dannoso. Tuttavia, i tassi di errore dei circuiti decisionali alla luce della variabilità cellulare di espressione genica sono finora rimaste inesplorate. Qui, si misura la funzione di risposta singola cella di una logica sintonizzabili e porta agendo su due promotori di popolazioni cellulari eterogenee. La nostra analisi rivela un compromesso intrinseco tra specificità e sensibilità che è controllato dal AND guadagno di amplificazione cancello e soglia di attivazione. Noi implementare un modello di coltura cellulare tumore mimando delle cellule tumorali emergenti in un contesto di quelle normali, e dimostrare che i parametri molecolari dei circuiti sintetici controllano specificità e sensibilità in un test di uccisione. Ciò suggerisce che, al di là del compromesso intrinseco, circuiti sintetici che operano in un ambiente eterogeneo potrebbero essere ottimizzati per indirizzare in modo efficiente stato maligno con una minima perdita di specificità. 1 M. M. e R. S. contribuito in maniera uguale a questo lavoro. 2 A chi corrispondenza può essere indirizzata. E-mail: Liorni weizmann. ac. il mit. edu o roy. bar-Ziv. contributi Autore: M. M. R. S. V. R. L. N. e R. H.B.-Z. M. M. di ricerca progettato e R. S. V. R. ricerca svolta contribuito nuovi strumenti reagentsanalytic M. M. R. S. L. N. e R. H.B.-Z. dati analizzati e M. M. R. S. V. R. L. N. e R. H.B.-Z. ha scritto il giornale. Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse. Questo articolo è un gene soppressore del tumore p53 PNAS diretto Submission. The è il bersaglio più frequente per alterazioni genetiche nei tumori umani (Hollstein et al. 1997). La proteina p53 wild type (WT) può esercitare una varietà di effetti anti-proliferativi, tra cui l'induzione di arresto del ciclo cellulare e dell'apoptosi (Levine 1997 Hansen e Oren, 1997). Questi effetti sono generalmente evidenti in cellule esposte a danni al DNA e di altri tipi di stress, che incidono sulla proteina p53 altrimenti latente e causano l'accumulo e l'attivazione biochimica (Levine 1997 Hansen e Oren, 1997). L'efficacia terapeutica di agenti anti-cancro dipende fortemente dalla loro capacità di innescare l'apoptosi nelle cellule tumorali bersaglio (Fisher, 1994). Molti DNA agenti fisici e chimici dannosi utilizzati di routine nella terapia del cancro sono potenti attivatori p53 (Kastan et al. 1991 Fritsche et al., 1993 Zhan et al. 1993). Dato il contributo documentato di p53 per apoptosi indotta da radiazioni (Clarke et al., 1993 Lowe et al. 1993), è stato possibile che le cellule mantenendo p53 WT funzionale saranno più inclini a uccidere da molti agenti anti-cancro. Numerosi successivi studi di base e clinici hanno fornito ulteriore supporto per questa nozione (Lowe, 1995). In tumori umani, la maggioranza delle alterazioni del gene p53 sono mutazioni di senso, spesso nel DNA conservati dominio di legame nucleo della proteina (Levine 1997 Hansen e Oren 1997). Il principale vantaggio selettivo di tali mutazioni potrebbe essere l'eliminazione di cellulari dell'attività wt p53. Tuttavia, in contrasto con le osservazioni di molti altri geni soppressori tumorali, cellule con mutazioni di p53 in genere mantengono espressione della intera lunghezza proteina mutante, i livelli spesso marcatamente elevati. Questo suggerisce che almeno alcune forme mutanti di p53 possono possedere un guadagno di funzione, per cui essi contribuiscono positivamente alla progressione del cancro (Michalovitz et al. 1991). Poiché mutanti p53 possono esercitare effetti dominanti negativi sulla co-espressi wt p53, prove formale di guadagno di funzione può essere ottenuta soltanto da introduzione di p53 mutante in cellule prive di p53 insieme (Michalovitz et al. 1991). Tale prova è stata fornita attraverso una combinazione di in vitro (Dittmer et al. 1993) e in vivo (Dittmer et al. 1993 del lupo 1984 Hsiao et al., 1994 et al.) Studi, in cui le proteine ​​p53 mutanti attribuite proprietà trasformati nella cultura e maggiore tumorigenicità nei topi. Ampie tentativi sono stati fatti per correlare lo stato di p53 con la prognosi e la terapia risposta dei pazienti affetti da cancro. La presenza di mutazioni di p53 è risultata prevedere peggiore prognosi e ridotta risposta alla terapia in molti (Lowe 1995 El Rouby et al., 1993 Wattel et al., 1994 Rusch et al., 1995 Righetti et al., 1996 Traubert et al., 1996 Hamada et al., 1996 Goh et al. 1995), anche se non tutti (Makris et al., 1995 Mathieu et al., 1995 Cote et al. 1997), tumori. La perdita di p53 attività peso potrebbe potenzialmente rendere pienamente conto della maggiore radio - e chemioresistenza dei tumori che portano mutazioni di p53. Tuttavia, se si accetta l'esistenza di guadagno di funzione mutazioni di p53, potrebbe essere motivata che alcuni dei apparente maggiore resistenza alla terapia può essere dovuto a dirigere effetti protettivi di proteine ​​p53 mutante. In realtà, il comportamento delle cellule leucemiche di topo che esprimono un sensibile mutante p53 temperatura è coerente con questo concetto (Lotem e Sachs 1995 Peled et al. 1996). Abbiamo quindi introdotto diversi tumorali derivate da mutanti di p53 umane in cellule di adenocarcinoma del polmone H1299 p53-null. saggi di sopravvivenza clonogenica hanno rivelato che le cellule overexpressing proteine ​​p53 mutante è diventato più refrattario agli effetti citotossici di farmaci chemioterapici. Ciò sembra dovuto, almeno in parte, alla capacità delle proteine ​​p53 mutante per conferire maggiore resistenza contro apoptosi indotta da farmaci. È importante sottolineare che l'effetto protettivo era mutant - e specifici farmaci. Così, p53His175 e p53His179 forniti sostanziale resistenza alle etoposide, mentre l'effetto protettivo di p53His273 e p53Trp248 era molto più mite. D'altra parte, p53His175 e p53His273 esercitata effetti praticamente identiche sulla risposta al cisplatino entrambi mutanti migliorati sopravvivenza marcatamente clonogenica e inibito l'apoptosi quando le cellule sono state trattate con concentrazioni basse di droga, ma non ha avuto effetto in presenza di elevate concentrazioni. Nel complesso, questi risultati suggeriscono che la sovraespressione di almeno alcune forme di p53 mutante può migliorare direttamente la resistenza delle cellule tumorali di agenti anti-cancro, in un modo che dipende sia dalla particolare mutazione e l'identità del farmaco. Tale guadagno selettivo della funzione potrebbe contribuire al fallimento della chemioterapia. Generazione di popolazioni di cellule H1299 che esprimono p53 mutanti per studiare mutante guadagno p53 della funzione, vari mutanti p53 tumore-derivato sono state trasfettate nella linea di cellule H1299 adenocarcinoma del polmone umano p53-null (Mitsudomi et al. 1992). Due strategie sono state impiegate per evitare variazioni clonali indesiderati. In uno cellule approccio sono state trasfettate stabilmente e diverse decine di colonie sono state raccolte insieme e mantenuto da allora in poi come un pool misto. Per ciascun mutante p53, due vasche indipendenti sono stati stabiliti e analizzati in parallelo. In un approccio alternativo, culture transitoriamente trasfettate sono stati analizzati direttamente. Tutte le piscine stabilmente trasfettate overexpressed livelli comparabili di corrispondenti proteine ​​p53 mutanti, mentre H1299 cellule trasfettate con vettore da solo è risultato negativo per p53 (Figura 1a). Immunocolorazione (Figura 1b) ha rivelato una localizzazione nucleare predominante di tutti i mutanti. Da notare, solo alcune delle cellule in ogni pool erano positivi per p53, suggerendo che il resto delle cellule portano solo resistenza ai farmaci. La frazione p53-positive era di circa 30 45 40, come determinato mediante colorazione per p53 seguita da analisi FACS (dati non mostrati). Etoposide promuove arricchimento selettivo di p53His175-overexpressing cellule Se p53 mutante può fornire una maggiore chemioresistenza, ci si potrebbe aspettare che il trattamento di una popolazione mista con farmaci citotossici appropriate arricchirà in modo selettivo per le cellule tumorali che iperesprimono tale proteina mutante. Per testare questa idea, abbiamo approfittato del fatto che solo circa un terzo delle cellule in ogni pool stabilmente transfettate in realtà sovraespresso p53. Piscine di H1299 cellule, trasfettate sia con p53His175 o p53His273, sono stati sottoposti ad un test di sopravvivenza clonogenica con o senza aggiunta di etoposide farmaco anti-cancro, un inibitore di topoisomerasi II. Il trattamento con etoposide (10 M concentrazione finale) è durato 48 ore. Il farmaco è stato quindi lavato, culture permesso di recuperare per altri 14 giorni, dando origine a colonie crescenti. Alla fine di questo periodo, le culture sono state fissate e singole colonie sono stati segnati da immunocolorazione per l'espressione di p53 mutante. Sono stati osservati tre tipi di colonie: quelli in cui 90 o più delle cellule colorate con forza (indicato in figura 2a veda anche la figura 5b), quelle in cui tutte le cellule erano negativi per p53 (denotati -), e un tipo intermedio dove solo una minoranza delle cellule erano fortemente macchiati, tipicamente al centro della colonia, perdita di espressione di p53 durante colonia escrescenza suggerendo (-). Quando p53His273 transfettanti (Figura 2a. H-273) sono stati placcati a bassa densità senza selezione etoposide, circa 30 delle colonie emergenti esposto vasta sovraespressione mutante p53 (bar vuoti,), mentre più della metà delle colonie erano praticamente p53-negativi (vuoto barre, --). Ciò corrisponde strettamente alla percentuale di cellule p53-positive all'interno del pool all'inizio all'esperimento, indicando che la presenza di p53 mutante non ha alcun effetto sulla efficienza di clonazione in condizioni non stressati. trattamento Etoposide comportato una drastica riduzione dell'efficienza complessiva della formazione di colonie (dati non mostrati), indicando che la maggior parte delle cellule nel pool trattata era stato danneggiato oltre il recupero. Eppure, tra le colonie che ha fatto alla fine emergono, il modello di mutante p53 sovraespressione era praticamente identica alla cultura non trattati (Figura 2a. Barre piene). Quindi, sovraespressione di p53His273 non sembra fornire cellule H1299 etoposide-trattati con qualsiasi sopravvivenza selettiva o vantaggio di crescita. Analisi di p53His175 transfettate cellule (H-175, Figura 2a) ha rivelato un quadro molto diverso. Come nella piscina H-273, solo una minoranza delle colonie originarie di culture non trattate conteneva almeno alcune cellule p53-iperespressione mutante (bar vuoti, e -). La proporzione di tali colonie (leggermente superiore 30) era ancora molto simile a quella delle singole cellule p53 sovraespressione del pool misto iniziale. Tuttavia, quando i placcati H-175 cellule sono stati trattati con etoposide e poi lasciati recuperare, la percentuale di colonie risultanti espongono vari gradi di p53 sovraespressione ora diventato molto più elevata, raggiungendo un totale di circa 75 (barre piene, e -). Quindi, colonie sovraesprimono p53His175 ma non p53His273 sono selettivamente arricchiti nelle culture etoposide-trattata. L'arricchimento per le colonie p53His175 potrebbe essere potenzialmente causa di un tasso di crescita più veloce intrinseca di tali colonie, piuttosto che ad un aumento della chemioresistenza. Per escludere questa possibilità, un saggio formazione di colonie comparativa è stata eseguita su colture non trattate. Come si vede nella figura 2b. nessuna differenza sia in numero di colonie o dimensione media delle colonie è stata trovata tra l'H-175 e le piscine di controllo H-neo. Presi insieme, questi risultati implicano che la sovraespressione di p53His175, ma non p53His273, fornisce un vantaggio selettivo di sopravvivenza clonogenica a H1299 cellule esposte all'azione citotossica di etoposide. p53 mutante conferisce resistenza selettiva l'effetto apoptotico di etoposide Una possibile spiegazione per i risultati sopra descritti potrebbe essere che p53His175 conferisce un effetto protettivo contro apoptosi etoposide-indotta. Per esplorare questa possibilità, le cellule di ogni pool transfettate sono stati trattati con etoposide e ordinati nella FACS base al loro contenuto p53. A tal fine, le cellule sono stati colorati con anticorpi specifici per p53. Quindi, utilizzando una procedura gating standard (Haupt et al., 1995 vedi anche Figura 4), ciascuna popolazione è stata risolta in alto (H) e bassa (L) expressors p53, quest'ultimo probabilmente corrispondente cellule colorazione negativa per p53 in Figura 1b. Come previsto, elevati expressors non sono stati rilevati nella piscina transfettate con un solo vettore (H-neo). I sub-popolazioni alta e bassa expressor entro un determinato pool sono stati quindi analizzati ciascuna separatamente per la presenza di cellule con contenuto di DNA sub-G1, indicativi di apoptosi (Haupt et al., 1995 Darzynkiewicz, 1995). Questo protocollo, che sfrutta la natura mista di ogni pool, consente il confronto diretto tra le cellule che esprimono p53 mutante abbondante e quelli che esprimono molto poco o del tutto assenti, tutte mantenute all'interno della stessa cultura e in condizioni sperimentali esattamente identiche. Di conseguenza, l'analisi è influenzata dalle fluttuazioni esperimento-to-esperimento in cinetica e l'estensione della apoptosi. I risultati di questa analisi FACS sono mostrati in figura 3a. In colture non trattate, la distribuzione del ciclo cellulare era praticamente identico tra i expressors alta e bassa p53 (dati non mostrati), ed era indistinguibile da quella delle cellule parentali H1299. L'esposizione a 10 M etoposide indotto vasta apoptosi nelle cellule H1299 vettori trasfettate (H-neo) oltre 40 delle celle visualizzate contenuto di DNA sub-diploide dopo 48 ore di trattamento. Inoltre, un accumulo prominente di cellule in G2 è stato osservato. Un profilo molto simile è stato rivelato dalla bassa expressor sotto-popolazioni di entrambi p53His175 e p53His273 piscine trasfettate (H-175, L e H-273, L, rispettivamente). Per contro, una drastica riduzione apoptosi è stata osservata nel suppopulation alta expressor (H) del pool H-175. Sorprendentemente, mentre le cellule overexpressing p53His273 anche apparso per sostenere l'apoptosi attenuata, questa apparente effetto protettivo era molto più mite che con p53His175. p53His179 anche conferito una sostanziale protezione contro l'apoptosi etoposide indotta quando sovraespresso in cellule H1299, anche se il suo effetto è stato un po 'meno pronunciato di quello di p53H175 (Figura 3a). D'altra parte p53Trp248 era relativamente inefficace, simile a p53His273. Una raccolta di dati provenienti da più esperimenti, impiegando due vasche indipendenti di ciascun mutante, è mostrato in Figura 3b. Un quadro analogo è stato ottenuto per H1299 cellule trasfettate transientemente con plasmide codificante p53His175, quando la coltura è stata analizzata per l'espressione di p53 e successivamente per il contenuto di DNA (Figura 4). Come previsto per trasfezione transiente, c'erano ancora un minor numero di produttori di alta p53, queste cellule erano significativamente refrattari a uccidere da etoposide, simili alle loro controparti stabilmente trasfettate. Nel loro insieme, tutte le risultanze di cui sopra indicano che p53His175, e in misura minore anche p53His179, conferisce H1299 cellule sostanziale protezione contro etoposide citotossicità. p53 mutante conferisce resistenza alle basse ma non alte concentrazioni di cisplatino Siamo accanto desideravamo sapere se i diversi mutanti di p53 potrebbero anche influenzare la risposta cellulare ad un altro farmaco anti-cancro, la cui biochimico meccanismo d'azione è molto diversa da quella di etoposide. A tal fine, abbiamo effettuato un saggio di sopravvivenza clonogenica sul stabilmente trasfettate H1299 piscine dopo il trattamento per 72 h con cisplatino (cis-DDP). Come si vede nella figura 5a. pannelli a sinistra, p53 mutante era effettivamente in grado di conferire una protezione parziale anche contro cis-DDP, quando applicato alla concentrazione relativamente bassa di 2,5 gml questo si è riflesso da un arricchimento di colonie p53-positive a circa 60 45 70 del totale, rispetto a circa il 30 45 35 in cellule non trattate. La Figura 5b mostra esempi rappresentativi delle tre diverse classi di colonie ottenute in questo esperimento. Tuttavia, a differenza dei differenti effetti di p53His175 e p53His273 sulla resistenza etoposide, nel caso di cis-DDP i due tipi di mutanti di p53 visualizzati molto simili Capacità cellule protettive overexpressing p53His273 sono stati arricchiti nel modo più efficiente di quelli iperespressione p53His175. Questo era strettamente correlato con una simile capacità di entrambe mutanti per proteggere contro H1299 induzione di apoptosi mediante questa concentrazione di cis-DDP, se analizzata al termine di un periodo di trattamento di 72 ore (Figura 6a). Un quadro decisamente diverso è stato rivelato quando le cellule sono state esposte a 10 GML di cis-DDP. L'elevata concentrazione completamente abolita la possibilità di H1299 dar luogo a colonie di crescita, a prescindere dal fatto che essi hanno espresso alcun p53 mutante, di conseguenza, non le colonie di sorta sono stati ottenuti nel test di sopravvivenza clonogenica (Figura 5 bis. Pannelli a destra). Questo è rimasto invariato anche dopo un periodo di recupero più lungo fino a 30 giorni dopo il trattamento cis-DDP (dati non mostrati), che implica che l'effetto di cis-DDP è irreversibile. Analisi dell'apoptosi dopo 48 h di esposizione a 10 gml cis-DDP rivelato che nessuno dei due mutanti avuto alcun effetto protettivo, contrariamente alla situazione visto con 2.5 gml del farmaco. Questo è coerente con l'incapacità di questi mutanti di offrire un vantaggio rilevabile nel saggio di sopravvivenza clonogenica (figura 5a). Sorprendentemente, la frazione complessiva di cellule con contenuto di DNA sub-G1 è in realtà inferiore con 2,5 gml, e un quadro simile è stata osservata anche quando i cis-DDP trattati culture sono stati esaminati dopo più o trattamenti più brevi con 10 GML cis-DDP (dati non mostrato). Questo suggerisce che H1299 rispondere a questa alta concentrazione cis-DDP in modo molto diverso rispetto agli altri trattamenti farmacologici studiati qui. Questo potrebbe comportare sia un tipo atipico della morte, con il DNA ridotta frammentazione del Andor perdita del DNA, oppure una mancata attivazione di una risposta adeguata alla morte a causa di una paralisi generale cellulare irreversibile. In ogni caso, questa risposta inusuale non è alterato da overexpressed p53 mutante. Descriviamo qui di una nuova funzione delle proteine ​​p53 mutanti sovraespressi frequente nei tumori umani. Questo si manifesta come una maggiore resistenza alle etoposide e cisplatino (cis-DDP), due agenti comunemente impiegati per la chemioterapia. Un quadro analogo è stato recentemente descritto per le cellule murine leucemiche M1, dove sovraespressione del topo mutante p53vall35 causato una maggiore resistenza all'apoptosi indotta da cisplatino, doxorubicina o - irradiation (Li et al. 1998). È concepibile che non tutti i tipi di cellule possono comportarsi in modo identico a H1299, come suggerito dal fatto che alcuni tumori e linee cellulari non riescono a mostrare l'accoppiamento positivo tra mutazioni di p53 e l'aumento chemioterapia e radioresistenza (al. Makris et 1995 Mathieu et al., 1995 Cote et al., 1997 Ribiero et al. 1997). gain biologica della funzione di p53 mutante è stata dimostrata in numerosi modelli sperimentali (es lupo et al. 1984 Dittmer et al., 1993 Hsiao et al. 1994). Diversi studi recenti hanno fornito ulteriore supporto per questo importante concetto, così come nuove informazioni sui meccanismi molecolari alla base. Lanyi et al (1998) hanno riportato che la porzione C-terminale di p53, compreso il legame al DNA specifico dominio nonsequence e il dominio di oligomerizzazione, è essenziale per la capacità di p53 mutante dotare cellule trasfettate con la capacità di indurre tumori nei topi. è stato anche richiesto Il C-terminale, e il dominio N-terminale di transattivazione e il dominio core idrofobico di p53, per l'attivazione di diversi promotori da proteine ​​p53 mutante (al. Lanyi et 1998). Una nuova attività molto interessante di p53 mutante è stato descritto da Gualberto et al. (1998), che ha trovato che alcune proteine ​​mutanti di p53 possono contribuire direttamente ad instabilità genomica con l'abrogazione del posto di blocco fuso mitotico nelle cellule umane, determinando così poliploidia ed eventuale aneuploidie. Da segnalare, solo mutanti conformazionale come p53His175 ma non DNA mutanti di contatto come p53Trp248 erano in grado di interrompere il checkpoint del mandrino (Gualberto et al. 1998). Questo è notevolmente ricorda i diversi effetti di questi mutanti sulla resistenza etoposide, come rivelato nella nostra analisi. Resta da stabilire se esista un rapporto meccanicistico tra questi due tipi di guadagno di funzione. Il meccanismo molecolare alla base di questa nuova attività biologica di p53 mutante ancora da chiarire. p53 mutante può aumenta l'espressione di una varietà di geni (ad esempio Chin et al., 1992 Deb et al., 1992 Dittmer et al., 1993 Tsutsumi-Ishi et al., 1995 Ludes-Meyers et al. 1996). Molto recentemente, il myc oncogene c - ha dimostrato di essere un obiettivo potente di molte proteine ​​p53 mutanti, possibilmente che rappresentano alcuni dei loro effetti cancerogeni (Frazier et al. 1998). È quindi possibile che p53 mutante altera anche l'espressione di geni associati con il controllo della morte cellulare indotta da chemioterapia in cellule H1299. Alcuni mutanti p53 possono attivare il promotore del gene di resistenza multifarmaco (MDR1) (Chin et al. 1992). Tale attivazione potrebbe spiegare in linea di principio per l'effetto anti-apoptotico apparente, impedendo la formazione di efficaci concentrazioni di farmaco intracellulari. Tuttavia, diversi fatti si oppongono a tale spiegazione meccanicistica. In primo luogo, non abbiamo potuto rilevare un aumento di MDR1 mRNA nelle piscine trasfettate (dati non riportati). In secondo luogo, p53His175 sovraespressione non ha influenzato la capacità di etoposide per imporre un arresto G2 (vedi Figura 3a), sostenendo che il farmaco era stato consegnato in modo efficiente nella cella. In terzo luogo, sia p53His273 e p53Trp248, che non proteggono efficacemente contro etoposide, induce il promotore MDR1 almeno altrettanto potentemente come p53His175 (Dittmer et al. 1993). Infine, la resistenza al cis-DDP non può essere fornito dalla glicoproteina MDR1, ma è stato comunque conferito da proteine ​​p53 mutanti nei nostri esperimenti. Quindi, se p53His175 agisce attraverso regolazione trascrizionale, i suoi obiettivi rilevanti sono suscettibili di essere geni diversi da MDR1. Una possibilità ovvia sarebbe upregulation dei geni anti-apoptotici, o repressione di quelli pro-apoptotici. A questo proposito, un precedente studio non ha trovato correlazioni tra mutazioni di p53 e espressione di diversi geni apoptosi-regolamentazione in linee cellulari di cancro polmonare farmaco-resistenti (Reeve et al. 1996). Resta quindi possibile che il guadagno anti-apoptotico della funzione è mediata attraverso un biochimico meccanismo indipendente di regolazione trascrizionale gene-specifica. Una possibilità interessante è che la proteina p53 mutante si lega e sequestra particolari proteine ​​necessarie per apoptosi efficiente. Possibili candidati potrebbero essere XPB e XPD (Wang et al. 1996), o le proteine ​​putative che interagiscono con il dominio polyproline di p53 (Walker e Levine 1996 Sakamuro al. Et 1997). La capacità dei diversi mutanti di p53 per alterare il siero-dipendenza delle cellule leucemiche K562 è stato recentemente valutato (al. Kremenetskaya et 1997). È interessante notare, si è constatato che p53His175 così come molti altri mutanti, ma non p53His273 e p53Trp248, reso queste cellule meno dipendenti da fattori di sopravvivenza di siero. La somiglianza tra il comportamento differenziale di questi mutanti di p53 in due diversi sistemi sperimentali rafforza l'idea che i mutanti, come p53His175 possono esercitare un ampio effetto anti-apoptotico sulle cellule tumorali. I nostri dati mostrano chiaramente che i diversi mutanti p53 può variare ampiamente in relazione alla potenza chemoprotective contro gli agenti definiti. Questo comportamento differenziale dipende dal sito esatta della mutazione, l'identità del farmaco, e anche la concentrazione del farmaco. Nel caso di etoposide, mutazioni come His175 e His179, che alterano la conformazione complessiva di p53 (Milner 1995), sono molto più potente di Trp248 e His273 che perturbare interazioni specifiche p53-DNA senza alterare la conformazione complessiva della proteina. Al contrario, entrambe le classi di mutanti di p53 sono ugualmente in grado di offrire maggiore resistenza alle basse concentrazioni di cis-DDP. I nostri dati suggeriscono che i tumori harboring particolari mutazioni di p53 possono essere meno sensibili ai particolari agenti antitumorali. Da segnalare, un'associazione non casuale tra specifiche mutazioni di p53 da un lato e una maggiore chemioresistenza e prognosi peggiore d'altra parte, è stato descritto per il tumore del colon-retto (Goh et al. 1995), il cancro al seno (Borresen et al., 1995 Bergh et al., 1995 Aas et al. 1996), il cancro ovarico (Righetti et al. 1996) e sarcomi dei tessuti molli (al. Traubert et 1996). C'è sovrapposizione parziale fra le mutazioni definite come più grave in quegli studi e nel presente uno questo potrebbe essere dovuto a differenze tra i vari tipi di tumore, come pure l'uso di farmaci chemioterapici distinte. In conclusione, i nostri risultati implicano che la presenza di particolari mutazioni di p53 può rendere un tumore meno sensibili a particolari regimi di terapia. Questi risultati dovrebbero essere estesi a linee cellulari aggiuntivi e devono essere raccolti e valutati con attenzione al fine di confermare la pertinenza in vivo dei risultati numerosi dati clinici. Alla fine, questo può fornire importanti indizi nei confronti delle decisioni terapeutiche migliori. Materiali e metodi linee cellulari, plasmidi e trasfezioni la linea cellulare H1299 è derivato da un carcinoma polmonare a grandi cellule umane (Mitsudomi et al. 1992). cellule H1299 sono state mantenute in terreno RPMI, addizionato con 10 siero fetale bovino (FCS). I mutanti di p53 umani utilizzati per trasfezioni sono stati descritti da Hinds et al. 1990). Espressione di tutti i mutanti era sotto il controllo trascrizionale del enhancerpromoter CMV. Prima di trasfezione, il terreno di coltura è stato cambiato in DMEM supplementato con 10 FCS. Trasfezioni sono state eseguite con il metodo del fosfato di calcio (Haupt et al. 1995). Dopo la trasfezione, il terreno è stato cambiato di nuovo al RPMI10 FCS e cloni stabilmente trasfettate sono stati selezionati in presenza di 0,4 mgml G418 per 1 settimana. Cellule analisi Western blot sono state lisate direttamente in tampone campione proteico, caricato su un gel SDS-poliacrilammide 12,5 e trasferiti su una membrana di nitrocellulosa. La macchia è stato sondato con una miscela degli specifici anticorpi monoclonali p53 PAb1801 umane e DO-1 e visualizzato con l'aiuto del kit ECL (Amersham). Le cellule che crescono su vetrini sono stati fissati con metanolo freddo ed incubate a -20176C per 30 min. Dopo rehidratation con PBS per 5 minuti, le cellule sono state colorate per 1 h con una miscela di PAb 1801 DO-1. Colorazione con l'anticorpo secondario e con DAPI sono stati eseguiti come descritto in precedenza (Haupt et al. 1995), seguita da visualizzazione al microscopio a fluorescenza. Cellule saggio di crescita Colony state seminate ad una densità di 2000 a piastre da 60 mm. Una settimana dopo colonie sono state fissate in metanolo a temperatura ambiente e colorate con soluzione Giemsa seguito da lavaggio con acqua. Clonogenica cellule del test di sopravvivenza che crescono su vetrini (5 180 10 5 cellule per piatto 100 millimetri contenente nove lamelle di vetro) sono stati trattati con 10 M etoposide per 48 ore o con 2.510 g cis-DDP per 72 ore. Le cellule sono state poi lavate due volte in PBS e rifornito con fresco RPMI 10 FCS. Due settimane dopo i vetrini sono stati fissati in metanolo freddo e colorate come descritto sopra. Le colonie sono stati visualizzati e ha ottenuto sotto un microscopio a fluorescenza. Per i controlli non trattati, 1 180 10 4 cellule sono state allo stesso modo placcati sulle colonie vetrini sono stati fissate e colorate dopo 1 settimana. Per l'analisi FACS, le cellule aderenti e staccati sono stati combinati. Le cellule sono state fissate, fatti reagire con una miscela di PAb1801 e DO-1 (1. 50) per 1 ora a temperatura ambiente e colorate con l'anticorpo secondario e con ioduro di propidio (25 gml Sigma) come descritto precedentemente (Haupt et al. 1995) . Le cellule sono state analizzate in un cell sorter FACSORT (Becton Dickinson). Soppressione per expressors alte e basse p53 era come descritto prima (Haupt et al. 1995). Ringraziamo T Unger, K Vousden e B Vogelstein per plasmidi di espressione di p53 e D Lane DO-1. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni RO1 CA 40099 dal NCI, la Fondazione Israele-Stati Uniti d'America binazionale Science, e il Leo e Julia Forchheimer Center for Molecular Genetics. GB è un ex borsa di studio AIRC. GB dedica questo lavoro a SM. Aas T, Borresen AL, Geisler S, Smith-Sorensen B, Johnsen H, Varhaug JE, Akslen Los Angeles e Lonning PE. (1996). Nature Med. 2, 811 45 814. MEDLINE Bergh J, Norberg T, S Sjogren, Lindgren A e Holmberg L. (1995). Nature Med. 1, 1029 45 1034. MEDLINE Borresen AL, Andersen TI, Eyfjörd JE, Cornelis RS, Thorlacius S, Borg A, Johansson U, Theillet C, Scherneck S, Hartman S et al. (1995). Geni Chromosom. Cancro 14, 71 45 75. MEDLINE Chin KV, Ueda K, Pastan I e Gottesman MM. (1992). Science 255, 459 45 462. MEDLINE Clarke AR, Purdie CA, Harrison DJ, Morris RG, Uccello CC, Hooper ML e Wyllie A. (1993). Nature 362, 849 45 852. MEDLINE Cote RJDE, Groshen S, Jones PA e Skinner DG. (1997). Nature 385, 123 45 124. Deb S, Jackson CT, MA Subler e Martin DW. (1992). J. Virol. 66, 6164 45 6170. MEDLINE Dittmer D, Pati S, G Zambetti, Chu S, Tereseky K, M Moore, Finlay C e Levine AJ. (1993). Nature Genet. 4, 42 45 46. MEDLINE El Rouby S, Thomas A, Costin D, Rosenberg C, Potměšil M, Silber R e Newcomb EW. (1993). Sangue 82, 3452 45 3459. MEDLINE Fraizer MW, Egli X, Wang J, Gu Z, Cleveland JL e Zambetti GP. (1998). Mol. Cellula. Biol. 18, 3735 45 3743. MEDLINE Fritsche M, Haessler C e Brandner G. (1993). Oncogene 8, 307 45 318. MEDLINE Gualberto A, Aldape K, K e Kozakiewicz Tlsty TD. (1998). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5166 45 5171. Articolo MEDLINE Hamada M, Fujiwara T, Hizuta A, Gochi A, Naomoto Y, Takakura N, Takahashi K, Roth JA, Tanaka N e Orita K. (1996). J. Cancer Res. Clin. Oncol. 122, 360 45 365. MEDLINE Haupt Y, Rowan S, Shaulian E, Vousden KH e Oren M. (1995). Geni Dev. 9, 2170 45 2183. MEDLINE Hinds PW, Finlay CA, Quartin RS, Baker SJ, Fearon ER, Vogelstein B e Levine AJ. (1990). Diff crescita delle cellule. 1, 571 45 580. MEDLINE Hollstein M, Soussi T, Thomas G, von-Brevern M and Bartsch H. (1997). Recent Results Cancer Res. 143, 369 45 389. MEDLINE Hsiao M, Low J, Dorn E, Ku D, Pattengale P, Yeargin J and Haas M. (1994). Am. J. Pathol. 145, 702 45 714. MEDLINE Kastan MB, Onyekwere O, Sidransky D, Vogelstein B and Craig RW. (1991). Cancer Res. 51, 6304 45 6311. MEDLINE Kremenetskaya OS, Logacheva NP, Baryshnikov AY, Chumakov PM and Kopnin BP. (1997). Oncol. Res. 9, 155 45 166. MEDLINE Lanyi A, Deb D, Seymour RC, Ludes-Meyers JH, Subler MA and Deb S. (1998). Oncogene 16, 3169 45 3176. MEDLINE Li R, Sutphin DP, Schwartz D, Matas D, Almog N, Wolkowicz R, Goldfinger N, Pei H, Prokocimer M and Rotter V. (1998). Oncogene 16, 3269 45 3278. MEDLINE Lotem J and Sachs L. (1995). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 9672 45 9676. MEDLINE Lowe SW, Schmitt EM, Smith SW, Osborne BA and Jacks T. (1993). Nature 362, 847 45 849. MEDLINE Ludes-Meyers JH, Subler MA, Shivakumar CV, Munoz RM, Jiang P, Bigger JE, Brown DR, Deb SP and Deb S. (1996). Mol. Cell. Biol. 16, 6009 45 6019. MEDLINE Makris A, Powles TJ, Dowsett M and Allred C. (1995). Lancet 345, 1181 45 1182. MEDLINE Mathieu C, Koscielny S, Le Bihan ML, Spielmann M and Arriagada R. (1995). Lancet 345, 1182. Michalovitz D, Halevy O and Oren M. (1991). J. Cell. Biochem. 45, 22 45 29. MEDLINE Mitsudomi T, Steinberg SM, Nau MM, Carbone D, DAmico D, Bodner S, Oie HK, Linnoila RI, Mulshine JL, Minna JD et al . (1995). Oncogene 7, 171 45 180. Peled A, Zipori D and Rotter V. (1996). Cancer Res. 56, 2148 45 2156. MEDLINE Reeve JG, Xiong J, Morgan J and Bleehen NM. (1996). Br. J. Cancer 73, 1193 45 1200. MEDLINE Ribiero JC, Barneston AR, Fisher RJ, Mameghan H and Russel PJ. (1997). Int. J. Radiat. Biol. 72, 11 45 20. MEDLINE Righetti SC, Della Torre G, Pilotti S, Menard S, Ottone F, Colnaghi MI, Pierotti MA, Lavarino C, Cornarotti M, Oriana S et al . (1996). Cancer Res. 56, 689 45 693. MEDLINE Rusch V, Klimstra D, Venkatraman E, Oliver J, Martini N, Gralla R, Kris M and Dmitrovsky E. (1995). Cancer Res. 55, 5038 45 5042. MEDLINE Sakamuro D, Sabbatini P, White E and Prendergast GC. (1997). Oncogene 15, 887 45 898. MEDLINE Traubert H, Meye A and Wurl P. (1996). Cancer Res. 56, 4134 45 4136. MEDLINE Tsutsumi-Ishi Y, Tadokoro A, Hanaoka F and Tsuchida N. (1995). Cell. Growth. Diff. 6, 1 45 8. MEDLINE Wang XW, Yeh H, Schaeffer L, Roy R, Moncollin V, Egly JM, Wang Z et al . (1996). Genes Dev. 10, 1219 45 1232. MEDLINE Wattel E, Preudhomme C, Hecquet B, Vanrumbeke M, Quesnel B, Dervite I, Morel P and Fenaux P. (1994). Blood 84, 3148 45 3157. MEDLINE Zhan QM, Carrier F and Fornace AJ. (1993). Mol. Cell. Biol. 13, 4242 45 4250. MEDLINE Figure 1 Expression of mutant p53 proteins in stable H1299 transfectants. ( a ) Western blot analysis. Cell lysates were prepared from the indicated stably transfected pools, resolved by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and subjected to Western blot analysis with a mixture of the human p53-specific monoclonal antibodies PAb1801 and DO-1, or with an anti - - tubulin antibody to control for equal loading. Positions and sizes (in kD) of protein molecular size markers are indicated on the right. ( b ) Subcellular localization. Visualization of transfected p53 was done by indirect immunofluorescence, employing a mixture of PAb1801 and DO-1. DAPI staining was done in parallel in order to visualize the nuclei of all cells in the same field, irrespective of p53 expression status. H-248, H-273, H-175, H-179 and H-neo denote pools of H1299 cells transfected stably with mutants p53Trp248, p53His273, p53His175, p53His179 or neo vector control, respectively Figure 2 Clonogenic survival and colony formation assays of pools overexepressing different p53 mutants, following treatment with etoposide. ( a ) Clonogenic survival assay of H-175 versus H-273 without or with etoposide treatment. Untreated cultures (empty bars) were plated at low density, and one week later were fixed, stained with a mixture of Pab1801 and DO-1 and scored microscopically for p53 expression. Cultures to be treated (filled bars) were plated at a higher cell density (see Materials and methods), incubated in the presence of 10 M etoposide for 48 h and then allowed to resume growth without etoposide for another 2 weeks, at which time they were processed for p53 analysis as above. Individual colonies could be grouped into three categories, based on their p53 staining pattern. The first group () included colonies consisting of 90 45 100 p53-positive cells, the second (--) consisted of only p53-negative cells, and the intermediate category (-) included colonies comprising a cluster of p53-positive cells surrounded by p53-negative ones. Each value represents the average of four separate experiments the standard error is indicated. The total numbers of colonies scored in each case were as follows: H-175 control, 936 colonies H-273 control, 1539 colonies H-175etoposide, 309 colonies H-273etoposide, 330 colonies. ( b ) Colony growth assay. Equal numbers of cells of the H-neo and H-175 pools were plated and stained as described in Materials and methods. Shown are three triplicate dishes of each pool Figure 4 Transient overexpression of mutant p53 confers increased resistance to cell killing by etoposide. A culture of H1299 cells was transfected transiently with p53His175 expression plasmid (5 g10 cm dish). Twenty-four hours later, etoposide was added to a concentration of 10 M for an additional 48 h. Cultures were analysed for p53 expression levels (left panel) p53 fluorescence is plotted forward scatter, serving as an approximation of cell size (forward scatter). The horizontal bar was set arbitrarily as the boundary between low (L) and high (H) p53 expressors the same cut-off was also used to define the H and L sub-populations throughout the experiments in Figure 3 a and b . Each of the indicated sub-populations was monitored separately for DNA content distribution (right panels) Figure 3 Stable overexpression of mutant p53 confers increased resistance to cell killing by etoposide. Each of the indicated stably transfected H1299 cell pools was either exposed to 10 M etoposide for 48 h or left untreated, and then subjected to flow cytometric DNA content analysis (see Materials and methods). Briefly, fixed cells were stained with propidium iodide (PI) and with p53-specific antibodies. Each population was first resolved into high (H) and low (L) p53 expressors, and then each of these two sub-populations was analysed separately for DNA content (PI staining). ( a ) DNA content profiles. Pool denominations are as in Figure 1a. Indicated below are the positions of cells with G1 and G2M DNA content, as well as of cells with sub-G1 DNA content, taken to be apoptotic. Percentages of cells with sub-G1 DNA content are indicated above the corresponding horizontal bars. For untreated cultures, only the low expressor fraction is shown the high expressor fractions exhibited practically identical cell cycle distributions, including a similar very low rate of background apoptosis (data not shown). ( b ) Compilation of data from several experiments of the type shown in a . Filled and empty bars denote the low and high p53 expressor sub-populations, respectively. Each bar represents the average of at least three separate experiments in most cases, data was acquired from two independent pools of H1299 cells transfected with the same p53 mutant. The standard error is indicated Figure 5 Clonogenic survival assay of H-175 versus H-273 without or with cisplatin treatment. Experimental details were exactly as in Figure 2, except that the indicated stably transfected H1299 pools were treated for 72 h with either 2.5 gml or 10 gml cisplatin (cis-DDP), and then the drug was removed and the cells were allowed to form colonies for another 14 days. ( a ) Clonogenic survival data see legend of Figure 2a for further details. The total numbers of colonies scored in each case were as follows: H-175 control, 872 colonies H-273 control, 1070 colonies H-1752.5 gml cis-DDP, 360 colonies H-2732.5 gml cis-DDP, 560 colonies. ( b ) The three types of colonies obtained in the clonogenic survival assay. Each panel depicts a segment of one representative colony, containing either only mutant p53-overexpressing cells (), or a mixture of p53-positive and negative cells (-), or only p53-negative cells (--). Further details as in Figure 1b Figure 6 Stable overexpression of mutant p53 confers increased resistance to cell killing by low but not high concentrations of cisplatin. The indicated stably transfected H1299 cell pools were treated with either 2.5 gml ( a ) or 10 gml ( b ) of cisplatin (cis-DDP). Cell cycle profiles were determined after 72 h of treatment, as detailed in Figure 3a. Only the treated cells are shown for untreated cell profiles, see Figure 3a